Диплом Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки (диссертация), номер: 50954

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................ 5
ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................... 6
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК................................................................................. 9
Распространение метилирования ДНК................................................................ 9
Функция метилирования ДНК.............................................................................. 12
Метилирование во время развития....................................................................... 13
Ферменты метилирования..................................................................................... 15
Метилирование как динамический процесс........................................................ 17
Роль метилирования в канцерогенезе.................................................................. 20
Генетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе................................. 22
Эпигенетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе........................... 23
Сравнительный анализ современных методов определения статуса
метилирования ДНК...............................................................................................
33
Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов...................... 33
Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в
опухолях...................................................................................................................
35
Заключение.............................................................................................................. 37
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................... 38
1. Список использованных реактивов.................................................................. 38
2. Клинические материалы.................................................................................... 40
3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур............................................... 41
4. Выделение ДНК из лейкоцитов........................................................................ 41
5. Рестрикция геномной ДНК................................................................................ 42
6. Бисульфитная модификация ДНК.................................................................... 43
7. Полимеразная цепная реакция.......................................................................... 43
7.1. Праймеры......................................................................................................... 43
7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми
праймерами.............................................................................................................
45
Стр.
- 3 -
7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими
праймерами.............................................................................................................
46
7.4. Метилспецифическая ПЦР............................................................................. 46
8. Выделение продуктов ПЦР из гелей................................................................ 47
8.1. Выделение продуктов ПЦР из полиакриламидного геля............................. 47
8.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля............................................ 47
9. Клонирование продуктов ПЦР…...................................................................... 47
9.1. Вектор.............................................................................................................. 47
9.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli...................................... 48
9.3. Трансформация клеток Escherichia coli........................................................ 49
9.4. Выделение плазмидной ДНК........................................................................... 49
10. Гель-электрофорез............................................................................................ 50
10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле........................ 50
10.2. Электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле........................ 51
10.3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем
полиакриламидном геле..........................................................................................
52
11. Блот-гибридизация........................................................................................... 53
11.1. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану...................................................... 53
11.2. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану......................................... 53
11.3. Получение меченого зонда............................................................................ 54
11.4. Гибридизация ДНК (РНК), иммобилизованной на мембране.................... 54
12. Обратная транскрипция................................................................................... 55
13. Переосаждение ДНК (РНК)............................................................................. 55
14. Анализ нуклеотидных последовательностей................................................. 55
14.1. Поиск гомологий в банках данных............................................................... 55
14.2. Критерии CpG-островков............................................................................ 56
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................................. 57
1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки..... 57
- 4 -
1.1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими
GC-богатыми праймерами....................................................................................
57
1.2. Анализ фрагментов, выявленных с помощью метилчувствительной
ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами.....................................
63
1.3. Определение статуса метилирования CpG-островка 32 при раке
шейки матки..........................................................................................................
70
1.4. Определение полного размера CpG-островка гена β3А-адаптина............ 72
2. Исследование экспрессии и статуса метилирования гена β3А-адаптина
при раке шейки матки............................................................................................
76
2.1. Исследование экспрессии мРНК гена β3А-адаптина в опухолях шейки
матки и в клеточных линиях рака шейки матки................................................
76
2.2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена β3А-адаптина в
опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.....................
78
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................... 86
ВЫВОДЫ............................................................................................................... 94
ЛИТЕРАТУРА...................................................................................................... 95